Введение

В настоящее время около 15–20% всех наступивших беременностей заканчиваются неудачно — это либо неразвивающаяся беременность, либо невынашивание (выкидыш). Также к данной категории можно отнести и внематочную беременность. Все эти состояния относятся к репродуктивным потерям беременности. Значительную долю среди них составляют неудачные попытки применения программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) — неразвивающиеся беременности после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и/или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ).

Принято считать, что в абсолютно здоровой супружеской паре может встречаться не более 3 случаев невынашивания беременности в сроках ранее 20 нед. беременности, и это не требует какого-либо лечения. Однако при превышении этого порога такое состояние называют привычным невынашиванием беременности (ПНБ) или привычным выкидышем. Существует мнение, что этот диагноз должен ставиться уже после 2 произошедших выкидышей, поскольку вероятность последующего невынашивания беременности после 2 и 3 выкидышей схожа. Частота ПНБ в популяции составляет 2% от числа беременностей. Риск повторного невынашивания после 2 выкидышей составляет 24%, после 3 -30%, после 4 — 40%.

Основными причинами ПНБ на сегодняшний день являются: хромосомные анеуплоидии, инфекции мочеполовой системы, нарушения гемостаза (предрасположенность к тромбофилиям, нарушения фолатного цикла и др.), антифосфолипидный синдром,.

Новый взгляд на роль мужчины при ПНБ

В то же время остается невыясненной роль мужского фактора в ПНБ. До сих пор считалось, что у мужчин необходимо только лечение инфекционно-воспалительных заболеваний мочеполовой системы. Следовало добиться эрадикации возбудителей инфекций, в т. ч. передающихся половым путем (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, гарднереллы и т. д.). Однако в последнее время были выяснены новые обстоятельства.

Как известно, с возрастом у женщин снижаются овариальный резерв и целостность ооцитов. У мужчин существует способность поддерживать определенный уровень фертильности в течение всей жизни, однако эта функция ухудшается постепенно. Наблюдаются снижение уровня половых гормонов, ухудшение сексуальной функции, ухудшение показателей сперматогенеза и, как следствие, снижение фертильности. Кроме того, увеличиваются неблагоприятные исходы беременности, мутации сперматозоидов de novo (растут на 4% в год), чаще встречаются хромосомные анеуплоидии. Все это приводит к репродуктивным потерям беременности или врожденным дефектам и заболеваниям у потомства.

Влияние отцовского возраста на качество спермы

Возрастные изменения обычных параметров спермы проявляются в сокращении объема спермы, уменьшении общего количества сперматозоидов, ухудшении подвижности и морфологии сперматозоидов. При этом концентрация сперматозоидов достоверно не меняется. Многие изменения до настоящего времени остаются предметом дискуссии. Этиология изменений связана с накоплением с возрастом сопутствующих заболеваний, таких как: сосудистая недостаточность (диабет, артериальная гипертензия), хронические инфекции (простатит и др.), ожирение, гормональная недостаточность. Однако до конца этиология все еще четко не определена.

Значение фрагментации ДНК сперматозоидов

Фрагментация ДНК сперматозоидов — нарушение целостности их ДНК, связанное с упаковкой патологического хроматина или дефицита протамина, оказывающее негативное влияние на репродуктивные исходы при естественном зачатии или в программах ВРТ. У бесплодных мужчин процент сперматозоидов с нарушением целостности ДНК — более 30%, у здоровых фертильных мужчин — менее 15%. При фрагментации ДНК спермы более 30% вероятность наступления беременности крайне низка.

В исследовании канадских авторов в 2014 г. продемонстрировано, что такие изменения приводят к уменьшению мужского фертильного потенциала, низкой частоте наступления беременности, а также репродуктивным потерям. Результатами этого являются не только снижение эффективности программ ВРТ, но и невынашивание или неразвивающиеся беременности. Также увеличивается вероятность возникновения хромосомных нарушений у детей, врожденных дефектов, и наблюдается уменьшение срока жизни потомства.

Сравнительный анализ 3 методов оценки повреждения ДНК сперматозоидов представлен в исследовании L. Simon et al. (США, 2014). 238 мужчин обследовались в центре репродукции при помощи методов COMET, TUNEL и флоуцитометрической оценки хроматина. Методы TUNEL и COMET оказались более точными предикторами успешности ВРТ, чем флоуцитометрическая оценка хроматина. При этом было показано, что подготовленная сперма вместо нативной в программах ВРТ может отличаться ятрогенным увеличением повреждения ДНК сперматозоидов. Кроме того, женские факторы могут снизить прогностическое значение анализа ДНК спермы

В недавно опубликованном метаанализе, в основу которого были положены результаты 16 когортных и 14 проспективных исследований (n=2969), было выявлено, что фрагментация ДНК сперматозоидов увеличивает риск невынашивания беременности после ИКСИ. Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов проводилась методами TUNEL и COMET. Риск возникновения неразвивающейся беременности после ВРТ/ИКСИ у больных с высокой степенью фрагментации ДНК сперматозоидов составил 2,16 (1,54–3,03) (р<0,00001).

С распространением ВРТ растет осознание важности повреждения ДНК спермы. На сегодня эти последствия еще в значительной степени неизвестны.

Бесплодные мужчины имеют значительно больше ДНК-повреждений спермы, чем фертильные мужчины, и это повреждение ДНК может негативно повлиять на репродуктивные исходы. Дефицит протаминов и воздействие активных форм кислорода могут быть причинами повреждения ДНК спермы. Повреждение ДНК сперматозоидов является вредным для исходов ВРТ. Тесты для оценки повреждения ДНК могут обеспечить лучшую прогностическую информацию, чем стандартные параметры спермы.

Этиология повреждения ДНК сперматозоидов

Этиология нарушений хроматина и повреждения ДНК сперматозоидов очень разнообразна. В первую очередь это первичные или внутренние дефекты сперматогенеза (аномалии развития или генетические дефекты), вторичные или внешние повреждения тестикул (гонадотоксины, гипертермия, оксидативный стресс, эндокринные заболевания). Патогенез повреждений ДНК связан с дефицитом протаминов, наличием активных форм кислорода, нарушениями апоптоза, нарушениями замены гистонов на протамины в сперматидах, плохой упаковкой хроматина, усилением чувствительности к оксидативному стрессу дефектных сперматозоидов .

В практическом плане к повреждению ДНК сперматозоидов приводят поздний отцовский возраст, варико-целе, инфекции мочеполовых путей, травмы спинного мозга, лихорадки, гонадотоксины .

Поскольку повлиять на возраст в настоящее время медицина не может, в стратегии по оптимизации фертильности предлагаются: устранение варикоцеле, здоровый образ жизни, использование антиоксидантов, применение новых достижений ВРТ, сокращение количества внеклеточной ДНК [6].

Влияние варикоцелэктомии на фрагментацию ДНК сперматозоидов

Что дает устранение варикоцеле? По данным метаанализа на основе рандомизированных проспективных исследований (Embase, Medline), после варикоцелэктомии отмечались: увеличение концентрации сперматозоидов на 12,3 млн/мл, подвижности — на 10,86% (p<0,001), а также уменьшение оксидативного стресса, фрагментации ДНК и улучшение ультраструктурной морфологии сперматозоидов. Частота наступления спонтанной беременности была выше, чем в группе наблюдения (отношение шансов (ОШ) 2,23, 95% доверительный интервал (ДИ) 0,86–5,78)

В другом метаанализе рандомизированных проспективных исследований оценивались: концентрация, подвижность, морфология, оксидативный стресс, фрагментация ДНК сперматозоидов и частота наступления беременности. Отмечено статистически значимое улучшение показателей у пациентов после варикоцелэктомии по сравнению с группой наблюдения (ОШ 2,69, 95% ДИ 1,16–6,24). Частота наступления спонтанной беременности составила 30%, наблюдалось уменьшение количества случаев невынашивания беременности в I триместре. По мнению авторов, главной альтернативой варикоцелэктомии является использование программ ВРТ [19].

В исследовании M. Smit et al. отмечено уменьшение фрагментации ДНК сперматозоидов после варикоцелэктомии. У 49 бесплодных мужчин с варикоцеле оценивались: спермограмма, индекс фрагментации ДНК и частота наступления беременности до и через 2 года после операции по поводу варикоцеле. В результате хирургического лечения варикоцеле концентрация сперматозоидов возросла с 4,8 до 14,3 млн/мл, подвижность — с 16,7 до 26,6% (у 63% больных — более чем на 50%). Индекс фрагментации ДНК сперматозоидов сократился с 35,2 до 30,2% (р=0,019). Спонтанная беременность наступила у супруг 37% больных, беременность после ВРТ — у 24%.

Также изменения качества ДНК спермы после микрохирургической варикоцелэктомии отмечены в исследовании американских авторов. 74 мужчины перенесли микрохирургическую варикоцелэктомию (27 — одностороннюю и 47 — двухстороннюю). Фрагментация ДНК (TUNEL) снизилась с 13,72 до 7,54% (р<0,001). Авторы сделали вывод, что микрохирургическая варикоцелэк-томия приводит к снижению высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов как одного из патогенетических путей возникновения мужского бесплодия.

Интересные данные о влиянии варикоцеле на спонтанные выкидыши в I триместре привели M. Ghanaie et al. В исследование были включены 136 мужчин с варикоцеле и нормальными параметрами спермограммы, жены которых имели ПНБ. Больным 1-й группы была выполнена варикоцелэктомия (n=68), 2-я группа была контрольной (n=68). В результате частота ПНБ в 1-й группе составила 13,3%, а во 2-й группе — 69,2% (р=0,01). Таким образом, устранение варикоцеле приводило к достоверному снижению количества случаев ПНБ. Концентрация сперматозоидов, время, прошедшее после операции, и возраст супруги — наиболее важные прогностические факторы успешного течения беременности.

Устранение неблагоприятных факторов риска нарушений фертильности

Следующим пунктом стратегии оптимизации фертильности является устранение неблагоприятных факторов риска развития бесплодия. К ним относятся ожирение, гиподинамия, курение, алкоголь, перегревание, баня (сауна), мобильные телефоны, Wi-Fi, ноутбуки и др..

В исследовании N. Zampieri et al. рассматривалось влияние коррекции неблагоприятных факторов образа жизни на качество эякулята у больных с бесплодием. Оценивалась спермограмма 52 курящих и употребляющих спиртное и кофе пациентов с бесплодием. У 76% мужчин, которые бросили курить или уменьшили количество сигарет, исключили кофе и спиртные напитки, включили в ежедневный рацион фрукты и овощи, наладили регулярную половую жизнь, отмечено улучшение показателей спермограммы.

Приведенные британскими учеными в метаанализе по влиянию мобильных телефонов на качество сперматозоидов данные о 1492 образцах спермы из 10 исследований свидетельствуют о том, что у пользователей наблюдалось снижение подвижности сперматозоидов на 8,1%, их жизнеспособности — на 9,1% (р<0,05). При этом концентрация сперматозоидов достоверно не менялась. Авторы указывают на необходимость дальнейших исследований в этой области и в области повреждения ДНК сперматозоидов.

Необходимо исключение профессиональных вредностей (работа на горячем производстве, в кулинарном цехе, контакт с тяжелыми металлами, пестицидами, полимерами, пылью, воздействие радиационного и электромагнитного излучения и др.).

Отмена лекарственных препаратов, потенциально ухудшающих показатели спермограммы (циметидин, блокаторы Са2+, спиронолактон, статины, некоторые антибиотики (нитрофурантоины, эритромицин, сульфаниламиды), трициклические антидепрессанты, ингибиторы обратного захвата серотонина, литий, химиотерапевтические препараты, ингибиторы 5а-редуктазы, а-блокаторы и др.), также может привести к улучшению фертильности за счет снижения повреждения ДНК сперматозоидов .

Антиоксидантная терапия

Эффект применения пероральных антиоксидантов и микроэлементов (супероксиддисмутаза, каталаза,глутатионпероксидаза, витамины Е, С, каротиноиды, уби-хинон, селен, цинк, фолиевая кислота, ацетилцистеин,L-карнитин, коэнзим Q10) оценивался в базе данных (Cochrane) мужчин из 2876 пар, проходящих программы ВРТ. Исследования показали, что употребление в пищу антиоксидантов и микроэлементов способствует повышению шансов на зачатие для субфертильных пар, прибегающих к использованию ВРТ. Дальнейший сравнительный анализ необходим для определения наиболее значимых микроэлементов .

Измерение способности сперматозоидов связываться с гиалуроновой кислотой применяется для прогнозирования возможности оплодотворения яйцеклетки во время ЭКО. А. Yagci et al. показали, чтогиалуроно-вая кислота обладает высокой селективностью связывания сперматозоидов с высокой целостностью ДНК [29]. В. Breznik et al. указали, что использование тест-пластин HBA является полезным для прогнозирования способности сперматозоидов к оплодотворению яйцеклеток в условиях ЭКО и отбора образцов спермы, подходящих для ЭКО и ИКСИ .

Данные исследования показали, что HBA-тест может использоваться для оценки целостности ДНК сперматозоидов. Повышение способности связывания с гиалуроновой кислотой означает увеличение числа более подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов с высоким уровнем целостности ДНК, что является признаком высокой вероятности эффективного оплодотворения и последующей нормальной беременности.

В современных публикациях широко обсуждается влияние микронутриентов на качество спермы. Целью работы австрийских авторов являлась оценка влияния препарата, содержащего 8 микронутриентов, на результаты теста связывания сперматозоидов с гиалуроновой кислотой в нативном эякуляте (HBA-тест) у мужчин с идиопатическим бесплодием в рамках открытого пилотного сравнительного исследования. В основную группу были включены 67 мужчин с идиопатическим бесплодием. В ходе исследования им было предложено в течение 3 мес. ежедневно принимать по 2 капсулы нутрицевти-ка, каждая капсула которого содержит L-карнитин,L-аргинин, цинк, витамин Е, глутатион, селен, коэнзим Q10 и фолиевую кислоту (PROfertil®). До и после исследования проводился анализ спермы. В группу контроля вошли 40 мужчин с бесплодием, не получавшие никакой терапии. У них также определялись изменения показателей HBA-теста по сравнению с исходными данными.

Было установлено, что результаты НВА-теста значительно улучшились в основной группе после 3 мес. лечения. Медиана показателей анализа изменилась с 56% в исходной точке до 74% в конце исследования (р<0,05). Полученная разница в основной группе была достоверно выше — на 19,7% по сравнению с исходным значением, при этом в контрольной группе показатели ухудшились на 2,1%. Доля пациентов с улучшением показателей НВА-теста через 3 мес. после исходного анализа была значительно выше в основной группе, чем в контрольной (74,6 и 30% соответственно, р=0,0001). Это свидетельствует о том, что у мужчин с бесплодием, получавших препарат, состоящий из микронутриентов, повысилась способность связывания сперматозоидов с гиалуроновой кислотой .

Применение данного подхода представляется важным для лечения бесплодия, т. к. низкие показатели целостности ДНК связаны со снижением вероятности естественного зачатия, уменьшением оплодотворяющего потенциала спермы, используемой в программах ВРТ, повышением частоты нарушений эмбрионального развития и выкидышей, а также увеличением вероятности заболеваний у новорожденных .

Вместе с тем роль антиоксидантов в улучшении качества спермы остается спорной — преимущественно по причине низкого качества большинства исследований и использования различных комбинаций антиоксидантов, их дозировок, а также различной длительности терапии. Частота наступления беременности, являющаяся наиболее значимым результатом, оценивалась только в некоторых исследованиях .

В рандомизированном исследовании иранских ученых оценивалось добавление антиоксидантной терапии к стандартной варикоцелэктомии в послеоперационном периоде. 1-ю группу составили 50 мужчин, перенесших ингвинальную варикоцелэктомию; 2-ю группу — 50 мужчин после ингвинальной варикоцелэктомии и приемаL-карнитина 250 мг 3 р./сут в течение 6 мес. Повреждение ДНК сперматозоидов сократилось к 3 мес. в 1-й группе до 10,4%, а во 2-й группе — до 5,6%. Однако к 6 мес. составило 9,8 и 7,8% соответственно. Авторы делают вывод, что добавление антиоксидантной терапии после варикоцелэктомии улучшает эффект через 3 мес. после операции.

 

 

Новые достижения ВРТ

Недавно опубликован метаанализ, в котором оценивалась эффективность интрацитоплазматической инъекции морфологически избранного сперматозоида под большим увеличением (ИМСИ) на исходы ВРТ при фрагментации ДНК сперматозоидов (Великобритания, 2014). В анализ были включены 54 пары (ИКСИ — 20, ИМСИ — 34). Индекс фрагментации ДНК составлял более 30% (TUNEL). Не было статистических различий в частоте наступления беременности (ИКСИ — 55,6%, ИМСИ — 52,9%), частоте рождения живых детей (50%) или выкидышей (ИКСИ — 5,6%, ИМСИ — 8,8%). Авторами сделан вывод о том, что ИМСИ не может улучшить исходы ВРТ при высоком уровне фрагментации ДНК сперматозоидов.

Однако метаанализ оценки состояния здоровья 1028 детей, рожденных после проведения ЭКО с 2005 по 2010 г., показал, что при применении ИМСИ наблюдалась более низкая частота основных пороков развития (1,33%), чем при стандартной ИКСИ (3,8%). Были собраны медицинские данные и катамнез в течение 2 лет после рождения. Эти 2 группы были сопоставимы по возрасту родителей, проведенному лечению, количеству ооцитов, дней переноса эмбрионов, гестационно-му возрасту и весу при рождении. Тем не менее частота основных пороков была значительно ниже с ИМСИ (6/450, 1,33%) по сравнению с ИКСИ (22/578, 3,80%; ОШ 0,35, 95% ДИ 0,14–0,87, р=0,014). В заключение подчеркивается благотворное влияние ИМСИ на результаты ВРТ [36]. Однако требуются дальнейшие исследования в данной области.

Внеклеточная ДНК и протеомика спермы

Хорошо известны ограничения традиционных методов анализа спермы в диагностике и лечении мужского бесплодия. Для его оценки используется все большее число сложных анализов, включая измерения фрагментации ДНК сперматозоидов, окислительного стресса и антиоксидантной способности. В последние несколько лет отмечаются огромные достижения в области про-теомики спермы, определения количества внеклеточной ДНК, что обещает революцию в диагностике и лечении бесплодия и ПНБ.

Заключение

Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов является важным прогностическим показателем. Показаниями к оценке фрагментации ДНК сперматозоидов являются: бесплодие неясного генеза при нормальных показателях спермограммы, ПНБ (неразвивающиеся беременности) у супруги, неудачные попытки использования ВРТ в анамнезе, поздний отцовский возраст.

Для устранения проблемы ПНБ в паре мужчине необходимо провести лечение инфекций мочеполовой системы, устранить варикоцеле, вести здоровый образ жизни, применять антиоксидантную терапию. Микрохирургическая варикоцелэктомия по собственной модифицированной методике повышает частоту спонтанной беременности и улучшает результаты ВРТ (в т. ч. при неудачных попытках в анамнезе). Варикоцелэктомия уменьшает оксидативный стресс и фрагментацию ДНК сперматозоидов, способствует сокращению репродуктивных потерь (особенно в I триместре беременности).

Таким образом своевременное обследование и лечение мужчины у квалифицированного андролога позволяет в значительной мере снизить риски репродуктивных потерь при использованииВРТ.